本技术描述了一种将特定物质封装于转染活性脂质囊泡(TCV)的方法。该方法利用无有机溶剂和去污剂的脂质囊泡,安全有效地传递DNA、RNA及其他核酸分子。
背景技术
科学研究和医学治疗的重要领域之一是希望选择性地和有效地将RNA、DNA、其他核酸和/或蛋白质货物(cargo)递送至靶位点,例如特定靶细胞。出于多种原因,这可能是有帮助的,包括改善患者治疗(例如基因治疗)以及用于治疗癌症和其他病况。例如,基因治疗可能能够用于大脑和整个中枢神经系统以治疗人类可能遭受的一些典型的可怕的神经系统病症,例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩等。目前的基因治疗方法在其广泛应用的同时存在几个问题,特别是对于人类患者而言,例如因为需要将治疗性核酸携带到患者体内的包装的重复施用和毒性。当前本文所述的组合物、方法等有助于解决一个或多个这些问题或其他此类问题。
关于将DNA和其他核酸递送到靶位点(例如脑中的患病细胞)的更科学的讨论,用于这种递送的现有方法包括脂质颗粒,在一些情况下被称为脂质纳米颗粒(“LNP”)或脂质体。术语脂质纳米颗粒或“LNP”用于描述在约中性pH下的脂基颗粒,其通常含有核酸并具有电子致密核。脂质体,也称为囊泡,是具有单个双层和水性核心的脂基结构。LNP形成的典型已知方法是在初始囊泡形成时将特定货物装载到囊泡。这些方法进一步使用专门仪器、有机溶剂和/或去污剂,需要大量材料并包括数天的处理时间,所有这些都严重阻碍了实用性、可及性和治疗可用性。
LNP和其他脂质颗粒通常包含可电离的阳离子脂质、一种或多种磷脂、胆固醇(Chol)和聚乙二醇-脂质(PEG-脂质)(Maurer,Wong等人,2001;Semple,Klimuk等人,2001;Semple,Akinc等人,2010;Belliveau,Huft等人,2012;Leung,Hafez等人,2012;Suhr,Coelho等人,2015)。(本文列出了讨论某些系统、设备、方法和其他信息的各种参考文献;无论参考文献在本申请中可能出现的位置,所有这些参考文献都通过引用整体并入本文并包括其所有教导和公开内容。本文对参考文献的引用并不是对这些参考文献构成本申请现有技术的承认。)LNP组合物的示例是比例为50/10/38.5/1.5mol%的可电离阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇(PEG)-脂质(分别)的组合。已表明该组合物在静脉内施用后显示出有效的肝细胞基因沉默(siRNA)或表达(mRNA)(Semple,Akinc等人,2010;Jayaraman,Ansell等人,2012;Pardi,Tuyishime等人,2015;Suhr,Coelho等人,2015)。其他人已经描述了由比例为50/10/38.5/1.5摩尔%的可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇(PEG)-脂质组成的LNP组合物,作为培养物中的原代神经元细胞的siRNA递送以及用于递送至脑(Rungta,Choi等人,2013)。
LNP制剂可以通过快速混合溶解在乙醇中的脂质组分和由核酸货物组成的酸性水相来产生(Jeffs,Palmer等人,2005;Belliveau,Huft等人,2012;Leung,Hafez等人,2012)。已建立的用于LNP制备快速混合方法包括通过交错的鲱骨状微混合器(staggeredherringbone micromixer,SHM)进行微流体混合(Belliveau,Huft等人,2012;Rungta,Choi等人,2013;Leung,Tam等人,2015),或者用专用泵进行的T-接合(T-junction)混合(Jeffs,Palmer等人,2005)或者更为过时的乙醇/去污剂-去稳定的装载预制囊泡的方法(Wheeler,Palmer等人,1999;Tam,Monck等人,2000;Maurer,Wong等人,2001;Semple,Klimuk等人,2001)。在所有三种方法中,需要乙醇溶液(或去污剂)以提供足够的膜流动性以进行脂质重组和包封,并且在SHM和T-接合技术的情况下,在乙醇溶液稀释进入水相时也发生了颗粒形成(Belliveau,Huft等人,2012;Zhigaltsev,Belliveau等人,2012;Zhigaltsev,Tam等人,2016)。然而,由于有机溶剂和酸性pH,所得悬浮液不是“即用”的,并因此所得悬浮液需要大量的下游处理。就材料成本和时间而言,这些方法对于在体外应用的实验室规模或直接施用的治疗水平上实现转染活性制剂来说具有明显障碍。
仍然存在对以无毒方式有效地将核酸和蛋白质货物递送到哺乳动物细胞中的转染试剂的需求,包括用于培养的哺乳动物原代细胞(通常,原代细胞是未转化的、直接从靶组织获得的非永生化细胞)。虽然使用原代细胞的重要性及其优于使用细胞系的优点已被充分了解,但转染此类细胞遇到的困难几乎已完全排除了将它们用于需要选择性基因敲低的任何类型的发现或验证研究。此外,向个性化医疗的发展正在推动在原代患者细胞中进行功能基因组筛选和验证,从而增加了对这些难以转染的细胞类型的稳健且无毒的转染方法的需求。
本发明的系统和方法等提供了解决这些困难中的一个或多个和/或提供其他优点的解决方案。
实现思路