本项发明属于水稻抗病育种技术领域,特别涉及水稻抗稻瘟病基因OsCBSX4的发现及其应用。该基因的编码序列(CDS)长度为693碱基对,对应编码一个由231个氨基酸组成的蛋白质。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界上最主要的粮食作物之一,但其稳定生产与增产一直受到多种病害的威胁,其中由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻主要病害之一,全世界稻区都有发生,一般可引起减产10-35%。实践证明,选育并推广具持久和广谱抗性的水稻新品种是防治稻瘟病最有效的方法之一。而通过对水稻免疫系统抵御病原菌入侵机制的研究,寻找广谱抗性基因并应用于农业生产,将为水稻抗病育种提供重要的理论指导和基因资源,极大加快水稻抗性的遗传改良及抗病分子育种的进程。
长期受病原菌的威胁,植物进化出一套复杂而精细的免疫系统来识别和防御病原菌的入侵,该免疫系统可分为两个层次。受病原菌保守成分PAMPs(pathogen-associatedmolecular patterns)所激发的免疫反应被称为PTI(PAMP-triggered immunity)是植物先天免疫的第一个层次,具有广谱性和持久性的特点。但是一些病原菌成功侵染宿主后,会向宿主细胞释放效应因子(effector)来抑制PTI。面对新的挑战,植物进化出第二层防御体系,通过细胞内部的抗病蛋白(R蛋白)特异性地识别效应因子,激活下游的抗病反应,重新获得抵抗病原菌侵染的能力,这第二层次的免疫反应也被称为ETI(effector triggeredimmunity),具有特异性和抗性强的特点。
CBS(Cystathionine-beta-synthase)蛋白即胱硫醚合成酶,在植物中的功能目前还鲜有报道,CBS蛋白通常被认为通过与Trx蛋白相互作用来调节植物的氧化还原稳态。如拟南芥CBSX1、CBSX2和CBSX3被报道通过与Trx蛋白互作参与花药发育的调控。RiteshKumar等人在本氏烟草中过表达OsCBSCBSPB4后,过表达烟草在盐、脱水、氧化和极端温度处理下,叶片衰老延迟,根系生长旺盛,生物量增加。Syed Adeel Zafar等人发现含有CBS结构域的DPS1基因与水稻花器官发育以及活性氧的积累有关。dps1突变体表现为顶端小穗退化,中间小穗不育,花药小,呈白色,角质层形态改变,花粉粒缺失,且穗部活性氧(ROS)积累增加和抗氧化活性降低,细胞程序性死亡增加,且DPS1与Trx1和Trx20互作,暗示DPS1可能通过与Trx1和Trx20相互作用参与ROS清除,从而调节ROS稳态。王学路团队研究发现,大豆CBS蛋白GmNAS1和GmNAP1通过感知根瘤能量状态以调节根瘤固氮能力。Mou等发现水稻OsCBSX3过量表达后可以显著增强水稻的稻瘟病抗性。这表明CBS蛋白在植物生长发育,生物及非生物胁迫中均发挥重要作用。Hemant R Kushwaha等人将拟南芥和水稻基因组中含有CBS结构域的蛋白进行了分析,发现拟南芥中有34个CBS蛋白,而水稻中有59个CBS蛋白,但是大部分植物CBS蛋白的功能还不清楚。
水稻全基因组序列的发布和现代分子技术基因工程的快速发展为抗病基因的发掘与利用提供了有效的手段,发明人在实验前期发现一个胱硫醚合成酶蛋白OsCBSX4受稻瘟菌侵染而诱导表达,用CRISPR/Cas9技术敲除该基因后导致水稻的稻瘟病抗性显著降低,而提高其表达水平则明显增强了水稻对稻瘟菌的抗性。因此,OsCBSX4基因存在提高水稻稻瘟病抗病的应用基础。
实现思路