本技术涉及一种基于塞姆利基森林病毒复制子的高效表达系统构建方法及其应用。该方法包括构建表达报告基因的saRNA系统和taRNA系统,其中复制酶由质粒提供。
背景技术
目前,两种主要类型的RNA被用作预防疾病的疫苗:一种是自我扩增的RNA(self-amplifying RNA saRNA),另一种是非复制的mRNA(non-replicating mRNA nrRNA)。saRNA疫苗就是一种基于RNA复制子的新型疫苗,其含有的RNA复制子是衍生于RNA病毒基因组并能自主复制的RNA,从而实现mRNA在细胞质内快速和大量的自我复制。最常用于开发复制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒(Alphavirus),如辛德比斯病毒(Sindbis virus,SIN)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)等。
SFV复制子疫苗主要来源于塞姆利基森林病毒的双顺反子基因组。对于疫苗工程,SFV基因组RNA中编码非结构蛋白的基因被保留,而亚基因组启动子控制下的结构蛋白基因被感兴趣的疫苗抗原取代。非结构蛋白自催化成熟并组装成多酶复制酶复合物,该复合物能够复制自己的模板RNA。复制酶作为RNA依赖性RNA聚合酶,顺式扩增RNA,导致接种宿主细胞中的高载体拷贝数,从而导致疫苗抗原水平高。因此,较低剂量水平的saRNA比nrRNA可能足以诱导类似的免疫反应。
最新研究表明,复制酶也能够扩增反式RNA,复制酶和抗原可以被分裂成两个RNA中,其中感兴趣的基因由缺乏复制酶的RNA表达,通过非复制mRNA反式表达,复制酶与携带外源基因的RNA相互作用的特异性是由缺乏复制酶的RNA从亲本saRNA继承的5’端和3’端区域的保守序列元件保证的。这种疫苗类型被称为基于二分裂SFV系统的反式扩增RNA(trans-amplifying taRNA)疫苗。该系统中疫苗抗原和复制酶组分编码在独立的载体上进行分裂,能够通过调整两种RNA的比例提高抗原表达水平,也可以通过增加抗原蛋白RNA种类,开发二价甚至多价疫苗。
这类疫苗生成的一个有前途的平台。saRNA疫苗不仅编码抗原基因,还编码RNA复制所需的基因,包括RNA依赖性RNA聚合酶。通常,sa RNA是一种病毒基因组,缺乏部分或全部病毒结构基因。由于缺乏病毒结构基因,不会发生感染性病毒颗粒的组装。同时,保留了复制病毒RNA所必需的基因,这些部分病毒RNA可以在细胞中复制。由于这种自我复制能力,repRNA本身可以发挥佐剂的作用,并可以引发强大的免疫反应。在小鼠、非人灵长类动物和人类等几种动物物种中,自扩增RNA作为候选疫苗是有效的。此外,据报道,即使有1/64千在RNA的使用量中,saRNA疫苗可以达到与合成mRNA疫苗相同的保护程度。repRNA疫苗以小剂量产生强大免疫力的能力使其成为可以降低制造成本并迅速结束COVID-19大流行的候选疫苗。
传统灭活或减毒疫苗需要较长的开发周期,而传统核酸疫苗抗原表达效率低,均难以满足需求。由于病毒复制酶的存在,基于病毒复制子的自扩增RNA(saRNA)疫苗不仅能缩短开发周期,且能够高水平表达疫苗抗原。因此,基于病毒复制子的saRNA疫苗有望打破疫苗开发的瓶颈。
目前,基于SFV复制子开发的RNA疫苗系统研究还不够深入,而taRNA疫苗系统研究甚少。许多抗原蛋白分子量较大,如IBVS蛋白,PEDV S蛋白,在一般载体中表达效率很低,甚至不能被表达。因此,本发明希望提出一种利用SFV复制子能够通过复制酶增加宿主细胞中高载体拷贝数和mRNA安全、高效、能诱导保护性免疫的特点开发基于SFV复制子的saRNA与taRNA疫苗系统,这种疫苗有望根据快速进化或新出现的病毒病原体的需要,快速和经济高效地生产大量疫苗。
实现思路