本技术涉及组织冻存技术,特别介绍了一种无血清玻璃化冻存液及其在组织保存中的应用。该冻存液由渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂和能量代谢调节剂组成,旨在提高组织冻存的效率和安全性。
背景技术
活体组织具有重要的临床和科研价值,能否实现长期高质量地维持组织体外保存的活性是实现这些价值的关键。一般认为,生物材料在深低温(小于-130℃)下,内部的动能和分子运动减缓,化学和生物反应速率降低,代谢、转运、酶反应和扩散等过程很弱,理论上可被无限期储存。深低温保存技术已成功应用于细胞、精子等单一的,小体积的生物材料的保存。但是,对于生物组织而言,其由多种多层细胞组成,其结构复杂性会限制热的传导和冷冻保护剂(CPA)的渗透,导致其原本的生理结构功能很难被完整保存。
近年来,探索复杂组织长期高质量冷冻保存已成为国际上新的研究热点。现有公开的专利中也涉及组织冻存液领域,主要包括:脐带(专利公开号:CN104472473A、CN113133444A、CN116941606A)、胎盘(专利公开号:CN116171984A)、脂肪(专利公开号:CN102907416A、CN106465710A、CN110547286A、CN109845728A、CN110973121A、CN111449055A)、肿瘤(专利公开号:CN107041362A、CN113475500A、CN114467913A)和卵巢(专利公开号:CN111789107A、CN111789106A、CN110074097A、CN110352949A)等组织,但是上述的组织冻存液存在以下不足。
首先,大多数冻存液的研发是基于程序化保存的原理,其包含精确而复杂的降温步骤,降温速度和时间需要昂贵的程序降温仪或其他仪器控制,并且降温保存中冰晶的生长会对细胞和组织造成致命的机械损伤。因此,近年来有研究者将目光投向了一种新的深低温保存技术——玻璃化保存,无需特殊仪器,可以直接投入液氮,程序简单、耗时短、成本低廉。更重要的是,玻璃化保存的本质是液体在冷冻固化过程中形成高度黏稠状态,且分子的运动受到高度约束,从而避免了冰晶生成的损伤。玻璃化保存的效果远优于慢速保存,被认为是长期保存大型组织和器官的唯一有前途的技术。
其次,现有的组织冻存液仅针对某单一组织进行研发,其配方简单,应用范围窄,可用于多种组织的冻存液仅有2篇。其中,中国发明专利CN114946836A公开了一种可用于乳腺类器官、肾癌类器官、膀胱类器官、小肠类器官和肺类器官的微组织冻存液,但其采用的是程序性保存技术,需严格控制降温速率为0.5~3℃/min,且24h后才能转入液氮中长期保存。最后,大多数的冻存液中含有胎牛血清,不仅存在成分不明的异种免疫原,在临床应用过程中会存在潜在的安全性风险。
理想的组织保存液应该具备以下特点:1)渗透性好,能渗透多层细胞进入组织内部;2)基于玻璃化保存的原理,最大程度地抑制冰晶生长等致命损伤以提高组织复苏后的活性,且无需昂贵的程序降温仪严格控制降温步骤;3)适用于多种组织的长期保存;4)避免引入动物血清等异种免疫原。目前尚无符合上述的特点的冻存液,因此,迫切需要建立一种适用于多种生物组织的无血清玻璃化冻存液。
实现思路