本研究聚焦于动物基因组编辑技术,特别是针对猪GDF11基因的三对特异性sgRNA的开发及其应用。通过CRISPR/Cas9技术,我们成功实现了对猪GDF11基因的精确敲除,为基因功能研究和遗传改良提供了新的工具。
背景技术
来自微生物的适应性免疫系统多聚规律性间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)通过一个短片段单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)来靶向所选择的基因组位点。这种编辑工具以它方便、廉价、精准的优势 迅速成为了生物科学界最热门的技术。通过CRISPR/Cas9系统切割基因组后,不仅能够通过 非同源末端修复(nonhomologous end joining,NHEJ)的方式进行修复,获得在切割位点附近的碱基缺失或插入,还可以通过同源重组修复(homology-directedrepair,HDR)的方式,实 现位点的突变和目的片段的插入与敲除。与ZFN和TALEN相比,CRISPR-Cas9发生NHEJ的概 率低、定点突变效率高、诱发双等位基因的效率高,既能提高HDR效率,又能避免脱靶效应 潜在的危险。到目前为止,CRISPR技术应用于各个领域,我们可以通过这种基因编辑方法来进行基因功能的研究、构建动物疾病模型。
生长分化因子11(Growth differentiation factor11,GDF11,BMP11)属于TGF-β超家 族,myostatin/GDF11亚家族和BMP亚家族一员,是一种在早期胚胎发育过程中起重要作用 的骨形态发生蛋白,对早期胚胎发育和许多组织器官的发生起重要调控作用。它在脊椎动物 中轴骨骼形成和附肢骨骼形成发育过程中都起着关键作用。GDF11基因缺失的纯合小鼠表现 出中轴骨骼图式缺陷,并伴有肾脏和嗅觉异常;GDF11基因敲除小鼠表现出躯干加长而尾部 变短或缺失。鉴于GDF11在中轴骨发育中的调控作用、GDF11基因敲除小鼠胸腰椎数增加和 基因组进化上的保守性,推测GDF11基因在猪中极有可能具有相同的调控作用。猪的胸腰椎数存在变异,而猪的腰椎数与胴体长度具有高度遗传相关性(相关系数为0.75),多胸腰椎 数性状的选择对改善商品猪的品质具有重要经济意义和应用价值。通过利用CRISPR/Ca9系统 对猪GDF11基因进行修饰,在体内和体外研究GDF11基因的功能,对于研究GDF11基因在猪 发育过程中的功能及其发挥作用的机制具有重要意义。而获得GDF11转基因动物的首要步骤就是找到能够特异性靶向GDF11的sgRNA,即该sgRNA与CRISPR/Cas9结合使用,能够对靶 点处进行编辑。本发明则提供了特异性靶向猪GDF11基因的sgRNA序列,为研究猪GDF11功 能机制以及制备GDF11转基因猪奠定基础。
目前,有关猪等哺乳动物GDF11的研究还比较少。通过利用CRISPR/Cas9系统[1],最终获 得GDF11基因敲除的猪或是追踪的转基因猪,而首要步骤都是找到能够特异性靶向GDF11的 sgRNA,通过sgRNA与CRISPR/Cas9系统结合使用,从而实现靶向编辑。
本发明提供了三对特异性靶向猪GDF11基因的sgRNA导向序列,通过这三种导向序列与 CRISPR/Cas9系统结合,不仅能够通过非同源末端修复机制造成猪GDF11基因外显子3起始 密码子ATG附近的碱基随机缺失或插入,进而导致GDF11基因的转录翻译紊乱,接着研究GDF11 基因缺失对猪肌肉发育的影响。或者通过同源重组的方式,利用外源导入的模板将基因组进 行重组,便可以在GDF11基因ATG上下游插入或敲除目的片段,进而实现GDF11基因的追踪, 从而进一步研究猪中GDF11标记细胞的去向。特异性靶向猪GDF11基因外显子3起始密码子 ATG附近位置sgRNA导向序列的确定为研究猪GDF11基因的功能机制以及制备GDF11转基因 猪奠定了基础,对于研究该基因在猪发育过程中的功能及其发挥作用的机制具有重要意义。
实现思路