本技术介绍了一种高效的甜瓜遗传转化技术及其应用。该方法涉及将甜瓜外植体与农杆菌共培养于无糖培养基中,以延长共培养时间至7-9天,显著提升农杆菌侵染效率,减缓其生长速度,降低外植体免疫反应,从而提高遗传转化效率。相较于传统含糖培养基方法,本技术通过无糖培养基和延长共培养时间,可将甜瓜转基因效率提高14倍以上。此外,本技术还提供了该遗传转化方法在制备甜瓜遗传转化产品中的应用。
背景技术
甜瓜是一种具有重要经济价值的水果作物,植物分子育种为甜瓜的定向育种和遗传改良提供了新的途径,利用转基因技术将基因引入甜瓜细胞并稳定遗传,从而创造新种质,是甜瓜育种的新方向。
农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程的重要技术,对植物基因功能研究及作物遗传育种具有重要推动应用。农杆菌介导的遗传转化包含外植体转化及被转化的组织或细胞再生为完整植株两个过程,其效率受到农杆菌的侵染活力、植物对于农杆菌的抵抗以及外植体的再生能力等因素的制约。但甜瓜的农杆菌遗传转化还存在效率低、周期长、费时费工等缺点。甜瓜遗传转化通常包括外植体准备、农杆菌侵染、共培养、芽诱导、生根等步骤。甜瓜遗传转化效率低的主要原因在于,农杆菌不能有效的将T-DNA整合到外植体中具有较强再生能力的组织/细胞中。遗传转化的共培养步骤,是农杆菌对外植体进行侵染,并且双元载体上的T-DNA片段整合到植物基因组上的环节,是决定甜瓜转化能否成功的最重要环节,该共培养阶段一般持续2~4天,延长共培养时间虽然对于促进农杆菌侵染,提高甜瓜转化效率具有一定潜力,但长时间的共培养往往会导致农杆菌过度生长,激发植物免疫防御反应,抑制外植体再生能力,甚至使外植体褐化、死亡。因此,提高农杆菌侵染能力的同时降低农杆菌对外植体的危害,是实现高效遗传转化效率的关键。
因此,现有技术中Xin等人利用纳米刷、超声、真空处理增加外植体的伤口,增加农杆菌的外植体内部的侵染强度,并且在共培养过程使用还原剂降低活性氧对于外植体的伤害;Parsa等人通过调整农杆侵染时菌液浓度,侵染时间等因素,促进农杆菌对外植体的侵染,并利用乙烯合成或信号转导抑制剂降到外植体对农杆菌的抵抗;Wan等人(Lili Wan等,Optimised Agrobacterium-mediated transformation and application ofdevelopmentalregulators improve regeneration efficiency in melons, Genes2023, 14(7), 1432)利用过表达发育调控因子,提高了甜瓜的再生效率。
上述措施对农杆菌介导甜瓜遗传转化效率有所提高,但甜瓜的转化效率还比较低,转化过程有待进一步优化。
实现思路