本技术涉及一种金黄色葡萄球菌核酸适配体的筛选和制备方法,旨在提高对这一常见致病菌的检测精准度和效率。该适配体的DNA序列(SEQ ID No:1)通过生物信息学和计算方法获得,包括分子模拟软件AutoDock对接实验,以及蚁群算法优化数据,以鉴定最佳结合序列。基于此适配体,开发了一种荧光淬灭型生物传感器,通过活化反应剂混合、荧光和淬灭探针制备等工序,实现对金黄色葡萄球菌的快速、特异性检测。该技术在食品安全和医疗诊断领域具有广泛应用,能显著缩短检测时间,降低成本。
背景技术
近年来,食源性致病微生物污染对食品安全的影响日益突出,给人们的健康带来极大威胁。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aure,S.aure)是一种重要的食源性致病微生物和人兽共患病原菌,葡萄球菌性食物中毒是摄入了受肠毒素污染的乳制品、肉类、蛋类制品引起的。S.aure广泛存在于自然界中,大约20%~30%的普通人群是金黄色葡萄球菌携带者,具有兼性厌氧、耐高温、高盐的特性,易存活,并随着人类和动物的活动进行传播,威胁人类和动物的生命安全。据世界卫生组织估计,全球每年约6亿人因食用受污染的食物而患病,约42万人死亡。在我国,约有10%~25%的食物中毒事件由金黄色葡萄球菌引起,严重威胁食品安全和国民健康。抗生素的不合理使用、甚至滥用的情况尤为突出,导致菌株耐药性不断增强。据报道,以耐甲氧西林金葡菌感染已经和乙型肝炎病毒、获得性免疫缺陷综合征感染并列为世界范围内3大难解决感染性疾病,所以对食品中金黄色葡萄球菌及其生物标志物的快速检测是保障食品安全的重要措施。
目前,金黄色葡萄球菌传统的检测手段主要是细菌增菌培养、形态学鉴定、生化鉴定等,整个鉴定过程耗时3~5d,且操作复杂;荧光聚合酶链反应检测方法的检测时间通常在1h以上,且设备昂贵,检测成本较高。
相比于传统的检测方法,通过核酸适配体结合金纳米粒子建立的检测传感体系不仅操作简单且具有较好的灵敏度,有望成为快速检测领域的新趋势。核酸适配体是指一种能够与特定目标物高亲和力和特异性结合的寡核苷酸片段,能够与靶物质结合。新兴的荧光生物探针的检测方法因其成本低、操作简便、响应快、耗时短、稳定性高,不需依赖大型仪器等优点,被广泛应用于靶标物质的测定。其中,荧光共振能量转移(FRET,resonance energy transfer)作为一种非辐射能量跃迁,通过分子间的电偶极相互作用,将供体激发态能量转移到受体激发态,在荧光探针检测技术中被广泛应用。硅纳米颗粒的相应研究较少,其常由含硅的偶联剂进行催化还原制备而得。基于荧光共振能量转移的方法大多通过缩短供体与受体之间的距离来实现,例如,利用偶联在微生物菌体表面上的比率型荧光探针位置上靠近来进行能量转移。比率型荧光探针因其具有高灵敏度、操作简单、对目标物的响应时间短等优势。当前,需要选择合适的可作为能量供体的第一荧光探针,并选择合适的可作为能量受体的第二荧光探针,来组成有效的FRET型荧光淬灭型生物传感器,但由于双适配体夹心的方式失败率较高,需要使用新的核酸适配体来组合使用,很容易出现菌体表面全被其中一种荧光探针占满致使另一荧光探针无法使用。
实现思路