本技术属于分子生物技术领域,提出了一种创新的基于核酶的靶向RNA抑制方法及其应用。该方法基于手枪核酶的保守核苷酸位点和结构,采用广义酸碱催化机制,能够为任何特定序列的靶标RNA设计核酶分子。这些核酶分子能在细胞内外特异性地切割靶标RNA,有效降低RNA及其下游蛋白质的表达水平。本发明对于开发新型核酸药物和RNA沉默技术具有重大意义,预示着广泛的应用潜力。
背景技术
核酶是一类特殊的非编码RNA分子,具有生物催化活性。目前在整个自然界中,从类病毒到脊椎动物,在高度多样化的基因组环境中发现了核酶。有一些分子量较小的核酶能够进行自剪切反应,对靶标RNA序列的特定位点进行切割。这类核酶包括锤头核酶、丁型肝炎病毒核酶、发夹型核酶、VS核酶、Glms核酶等。这些核酶的生物学作用包括RNA基因组的滚环复制过程中的自我剪切、反转录转座子的共转录加工以及细菌中代谢物依赖的基因表达调控等。核酶作为一种具有酶活性的RNA分子,能够持续、高效、特异性地剪切靶基因的mRNA从而调控基因的表达,因此是一种潜在的基因治疗工具。
目前核酶已经用于功能研究和治疗目的,包括在抗病毒、抗肿瘤等方面的应用研究。在生物医学研究中应用较多的核酶主要为各类自体剪切型核酶和RNase P。例如,Lu和同事设计了一种靶向p185 mRNA的锤头状核酶,观察到HER-2 mRNA以及在HER-2途径末端产生的致癌基因k-ras在用该核酶转染的细胞中被下调,并且在裸鼠中引起致癌性显著下降,说明使用抗HER-2核酶有助于乳腺癌的基因治疗;另一项研究中,开发了四种锤头状核酶腺病毒以靶向抗细胞凋亡因子存活蛋白mRNA的单链区域,结果显示三种核酶的共表达足以显著降低存活蛋白表达并产生最有效的抗癌作用。Nazari等人用多聚体锤头状核酶RZ1-7切割CCR5 mRNA导致几乎完全抑制CCR5-向性HIV-1复制,因此是HIV-1基因治疗的有希望的工具。核酶的使用似乎是RNAi技术的有前途的替代品,因为尚未观察到脱靶的发生。因此,核酶是一种有前景的基因治疗工具,未来将会在抗肿瘤、抗感染等临床应用中发挥巨大作用。但是目前基于脱氧核酶、锤头状核酶开发的核酶药物分子存在体内稳定性差、酶活性不足、脱靶效应严重、毒性较大、靶向选择位点不够丰富等缺陷,急需新型的核酶设计方法来改善。
手枪核酶是新发现的一类小型核酶,常见于厚壁菌门,一般位于噬菌体相关基因附近,在鱼类等脊椎动物的基因组中也有发现。手枪核酶序列中有10个高度保守的核苷酸和很多其他适度保守的核苷酸,保守的核苷酸在溶核活性中起关键作用,可变的核苷酸与其结构和生物化学性质的轻微差异相关,该核酶具有一种全新的广义酸碱催化机制,利用G40位点N1作为广义碱攻击临近的磷酸基团,发生酯转移反应,然后通过一个水合镁离子基团作为广义的酸提供一个质子给离去基团、完成催化。手枪核酶可能通过改造成为靶向识别并抑制含有特定序列的靶标RNA,使基于手枪核酶进行靶向药物设计和基因沉默技术的开发成为可能。
实现思路