本技术涉及一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA疫苗构建技术。该技术整合了马立克病病毒糖蛋白gC和gD基因、IL-18基因、自裂解多肽P2A和T2A以及真核表达载体,提供了详细的构建流程和应用指南。该方法具有操作简单、制备快速、适合大规模生产的特点。通过重组酶技术,实现载体与目的基因的同源重组,使得PCR克隆产物可直接用于重组,三个目的基因得以独立表达。此方法有助于抗原基因产物在体内的加工和递呈,确保了疫苗的安全性、稳定性以及便于保存和运输。动物实验结果表明,接种该DNA疫苗的三黄鸡体重正常增长,无不良反应,且能激发明显的体液免疫和细胞免疫反应。
背景技术
马立克病(Marek’s disease,MD)是鸡的一种常见的T淋巴细胞增生性肿瘤病,由高度细胞结合性的α-疱疹病毒马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起,主要的特征性病理变化为单核细胞浸润外周神经、虹膜、皮肤组织和其它实质内脏器官,病鸡表现为快速形成淋巴样肿瘤,免疫抑制和麻痹。MDV是有囊膜的双股线性DNA病毒,基因组长度约为170kbp,包含338个开放阅读框(Openreading frame,ORF),其中103个可能是功能基因,编码的病毒蛋白超过60个,研究较多的有致瘤蛋白Meq、pp38和v-IL8,以及与病毒入侵和传播相关的囊膜糖蛋白gB、gC、gE、gI、gM等。
传统的MD疫苗主要以参与病毒复制的蛋白为靶点,不能诱导产生中和免疫,因此存活下来的野生型毒株可能容易发生变异,致使毒力逐渐增强。尽管疫苗仍然是目前防控MD的有效手段之一,但近年来特超强MDV毒株(Very virulentplus MDV,vv+MDV)的不断出现,突破了现有最好疫苗的保护作用,导致越来越多的鸡群感染MDV,包括种鸡、蛋鸡以及我国南方地区长期饲养的优质鸡,给我国养鸡业构成了不容忽视的威胁。此外,多联苗的使用会导致B淋巴细胞机能障碍,造成鸡群免疫力下降。除火鸡疱疹病毒以外,其它MD疫苗均有严格的活细胞结合性,必须用液氮保存,增加了疫苗的运输成本。
因此,利用基因重组技术研制新型MD疫苗有望弥补现有疫苗的不足,提高鸡群抵抗MD的能力,提升养殖效益。
MDV编码的糖蛋白C(Glycoprotein C,gC)是作为α-疱疹病毒亚科的一种多功能蛋白,由甲型疱疹病毒UL44的同源基因编码合成,与病毒的附着、稳定性和毒力有关。已有研究证实gC与MDV的水平传播密切相关,缺失gC基因的病毒突变体其水平传播能力显著下降。糖蛋白D(Glycoprotein D,gD)也是疱疹病毒家族的最保守糖蛋白之一,由US6基因编码产生,在病毒入侵机体的过程中除与细胞受体(NECTIN-1或HVEM)发生结合外,还会激活病毒融合装置的下游组分。同时,gD具有较高的免疫原性。
虽然糖蛋白gC和gD在MD致病过程中发挥重要作用,但目前广泛使用的商品弱毒疫苗(如CVI988、814株等)感染细胞后产生的结合型gC表达量很低,也几乎检测不到gD表达。现有MD弱毒疫苗的重要缺陷之一就是不能提供完全保护,即无法阻止病毒感染和机体排毒。这可能与关键糖蛋白gC和gD非正常表达,导致针对gC和gD的免疫反应不足有密切联系。
白细胞介素-18(IL-18)是由巨噬细胞产生的一种重要的细胞因子,在先天性免疫与获得性免疫中发挥重要的作用,可在DNA疫苗中起佐剂作用增强体液和细胞免疫应答。温纳相(2003)曾将表达pcDNA3.1/ChIL-18DNA疫苗和新城疫灭活苗联合注射鸡只,结果显示,用常规ND灭活苗与ChIL-18基因重组真核表达质粒联合注射,比只用常规ND灭活苗免疫鸡T淋巴细胞转化功能有明显提高。
重组DNA疫苗是通过将外源基因克隆入真核表达载体中,将重组质粒注射到动物体内,使外源基因在机体内表达形成抗原,诱导机体产生免疫反应。与传统的灭活疫苗相比,重组DNA疫苗不仅能诱导机体的体液免疫应答,而且能诱导机体产生细胞免疫应答。与传统的弱毒活疫苗相比,重组DNA疫苗具有安全、成本低、易保存、制备简单的优点。
因此,如何提供一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA疫苗构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
实现思路