本技术介绍了一种侏儒蛤精子的玻璃化冷冻保存方法,属于海洋生物技术领域。该方法包括:(1)选取繁殖期侏儒蛤,通过阴干和变温刺激自然排放精子,经过过滤、离心得到高密度精子,冰上保存;(2)将高密度精子与含有二甲基亚砜、辅酶Q10和聚蔗糖的冷冻保护液混合,制成混合精子溶液;(3)将混合精子溶液转入冷冻管,直接浸入液氮保存。该方法在50~60ºC温度下解冻60~64秒后,D形幼虫率达到80%以上,实现了样品的长期液氮保存。
背景技术
精子超低温冷冻保存技术自上世纪50年代首次成功以来,经过半个多世纪的发展,目前在动物种质资源保护和遗传育种研究中发挥重要作用。目前,传统精子超低温冷冻保存方法(非程序性和程序性超低温冷冻)已在水产养殖中被广泛应用,包括海水双壳贝类牡蛎、贻贝和扇贝等,但该方法需借助相关冷冻装置或仪器来完成超低温冷冻步骤,耗时、耗力。本申请的精子玻璃化超低温冷冻,是将样品处理后直接放入液氮进行冷冻保存,不需借助冷冻装置或仪器便可快速完成冷冻过程,更省时、省力、方便、简单和较低的生产成本,便于在遗传育种生产实践中推广应用。目前,该方法在海水双壳贝类中还没有报道。
此外,目前研究的经济海水双壳贝类,由于其繁殖周期较长,并且其大部分时间都生长在海上不好管理,对于该方法的应用和研究具有一定的困难。因此,选择一个适合的模式生物进行研究非常重要。侏儒蛤具备双壳贝类特征,已作为海水双壳贝类模式生物。目前,以侏儒蛤为研究对象,开展的研究结果已应用于经济海水双壳贝类中,如Yang and Guo(Polyploid induction by heat shock-induced meiosis and mitosis inhibition inthe dwarf surfclam, Mulinia lateralis
Say. Aquaculture, 2006)开发海水双壳贝类多倍体繁育方法,Wang等人(Functional characterization of Cfap206 for bivalveciliogenesis by RNAi and CRISPR/Cas9 technologies. Frontiers in MarineScience, 2022, 9: 864037)运用基因编辑技术开展双壳类纤毛发生功能的研究,Guo等人(Full-length transcriptome analysis provides insights into larval shellformation in Mulinia lateralis
. Frontiers in Marine Science, 2023, 9: 1111241)进行双壳贝类幼虫贝壳形成机制的研究。同时,与其它海水双壳贝类相比,侏儒蛤不仅具有性成熟周期短(大约3个月)的特点,而且侏儒蛤整个生命周期养殖方法和基因组均已由本实验室建立完成。因此,侏儒蛤是研究海水双壳贝类精子玻璃化冷冻理想材料。同时,本申请人已开发了侏儒蛤非程序性超低温冷冻保存方法,本发明的玻璃化超低温冷冻方法在保证冻融后精子质量的前提下,较之前的方法更加省时,省力以及易于标准化操作。
实现思路