本技术介绍了一种高效制备细胞源性靶向纳米囊泡的方法及其在医药领域的应用。该纳米囊泡具有高产量、小粒径和窄粒径分布的特点，作为药物载体时展现出卓越的包封率和载药率。在玻璃体腔注射中，药物分布更广泛，吸收速度更快。特别地，通过改造Lamp2b蛋白并结合靶向肽，赋予了纳米囊泡靶向能力。这种纳米囊泡因其高产量、强靶向性，在治疗和药物载体方面具有显著的应用潜力和研究价值。
背景技术
由细胞释放到细胞外或血浆中而进入血液循环、被称为“细胞外囊泡”（extracellular vesicles， EVs）的细胞分泌物已经得到了广泛的关注和研究。“细胞外囊泡”主要分为外泌体（exosome）、微泡（microvesicle）或微颗粒（microparticle）和凋亡小体（apoptotic body）三类，其中主要成分是外泌体。目前，外泌体被广泛用于多种损伤修复及免疫性疾病的治疗。然而，外泌体其细胞靶向性仍需进一步提高，以减少副作用和提升疗效。其次，细胞分泌外泌体的效率有限，收集一定量的外泌体需要投入大量时间。因此，进一步提升其靶向性、生物安全性和产量是未来需要解决的问题。
细胞纳米囊泡的修饰策略包括基因工程和化学修饰。利用基因工程将目的蛋白或多肽的基因序列与选定的外泌体表面蛋白的基因序列融合，可使目的蛋白或引导肽表达于外泌体表面。溶酶体相关膜蛋白2b（Lysosome associated membrane protein 2b,Lamp2b）是Lamp家族成员，是一种可用于携带靶向蛋白或多肽的膜蛋白。
另外，在细胞内还存在大量纳米囊泡，游离在各种富有膜的细胞器之间，介导细胞内物质运输及细胞的分泌途径。其中构成型分泌囊泡是细胞内囊泡（intracellularvesicle，IVs）的主要类型，由内质网产生，与高尔基体、溶酶体和细胞膜等进行物质交换，介导了细胞内各种分泌蛋白的产生、运输及分泌。其内容物丰富，含有大量的分泌型蛋白、脂质和核酸分子。迄今没有关于如何对细胞内纳米囊泡进行富集和应用的报道。除此之外，我们前期结果中发现相较于EVs，这些细胞内纳米囊泡粒径更小，跨膜蛋白Lamp2b含量更多，具有更高的药物递送效率，更适合用于疾病治疗及其药物递送。
自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis）是一类常见致盲性眼病，主要累及葡萄膜和视网膜，可引起白内障、青光眼、黄斑病变和视神经萎缩等多种眼部并发症，导致视力严重下降。CD4阳性辅助性T细胞（T helper cells, Th cells），特别是分泌IFN-γ的Th1和分泌IL-17A的Th17细胞，是自身免疫葡萄膜炎的主要效应T细胞，它们的异常激活在疾病发生中发挥重要致病作用。CD40L属于TNF超家族，被认为是CD4 + T淋巴细胞的早期激活标记。CD40/CD40L参与触发下游多种免疫信号通路，早期研究已证明CD40/CD40L共刺激信号传导是产生T细胞依赖性抗体应答和记忆B细胞分化所必需。巨噬细胞和DC细胞中CD40/CD40L信号激活后，诱导细胞因子分泌和表面活化分子表达，参与调节CD4 + T细胞和CD8 +T细胞交叉刺激和激活。在各种自身免疫性疾病中也存在CD40/CD40L信号通路表达调控失调，其可能促进致病性自身免疫反应的启动或维持。因此，靶向CD40/CD40L通路有望成为自身免疫性疾病新的治疗策略。
病理性视网膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）是几种常见致盲性视网膜疾病的关键病理变化，包括糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、糖尿病性黄斑水肿、视网膜血管阻塞、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP) 等。目前的临床治疗包括玻璃体内注射anti-VEGF药物、视网膜光凝和玻璃体切割，尽管玻璃体内注射anti-VEGF药物可以抑制视网膜和脉络膜NV的进一步形成，但其治疗效果一直存在争议，大约30%的患者对anti-VEGF药物治疗的反应不佳，并且激光和手术治疗效果有限，仍有相当数量的患者丧失视功能。因此，需要寻找更有效、更安全的替代方法。
既往研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）具有促进创伤修复、神经保护等作用，广泛用于视网膜和神经系统疾病的治疗研究。但由于其具有细胞增殖的劣势限制了其临床转化及应用。MSC衍生的囊泡具有干细胞的生物学特性，无核无遗传物质，具有极大的转化应用前景。对囊泡进行改造，使其具备靶向性可以提高囊泡的生物利用率。因此，对细胞内纳米囊泡进行针对性改造，使其具备靶向性，进行自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病研究，并寻找治疗自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病药物具有重要意义。
实现思路