本技术介绍了一种通过EIN3/EILs转录因子CrEIL1提高长春花中长春碱含量的方法及其含量测定技术。该方法包括克隆长春花CrEIL1基因，构建pLB-CrEIL1质粒载体，利用该质粒载体构建CrEIL1过表达载体，并通过根癌农杆菌介导实现CrEIL1在长春花中的过量表达。该技术能够以低成本、环保且可靠的方式提升长春花中长春碱的产量。
背景技术
长春花(Catharanthus roseus(L.)G.Don)，作为研究萜类吲哚生物碱(terpenoidindole alkaloids,TIAs)的模式植物之一，能够产生近200种萜类吲哚生物碱。TIAs是植物长期适应生态环境过程中产生的，用于保护自身的一类次生代谢产物，其中一些具有很强的药理活性，主要用于各种疾病的临床治疗。长春花体内萜类吲哚生物碱包括阿玛碱(ajmalicine)、文多灵(vindoline)、长春质碱(catharanthine)、蛇根碱(serpentine)、长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)等。双吲哚生物碱长春新碱和长春碱在大多数针对霍奇金淋巴瘤、淋巴肉瘤，神经母细胞瘤，和乳腺癌、肺癌和儿童白血病的化疗中占据了不可或缺的位置。目前美国已批准一批以长春新碱为原料的商用药，如长春瑞滨(vinorelbine)为长春新碱的硫酸盐，其功能为对急性白血病、乳腺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、慢性淋巴细胞白血病等癌症的治疗极为有效。另外有研究表明，阿玛碱和蛇根碱用于治疗循环系统疾病，尤其是缓解脑血管病性精神障碍和过敏反应，文多灵和长春质碱在降低血脂方面有一定的效果，可用于治疗糖尿病等疾病。
目前只有长春花是生产长春碱与长春新碱的唯一植物来源，而且长春花植株干重中仅含万分之一的双吲哚生物碱(近500-750kg干叶仅产生1.0克长春碱)，提取成本高。体外培养的细胞合成生物碱的难度较大，没有经过特定诱导难以产生TIAs，目前已有报道可采用人工半合成，但底物仍须从长春花提取，且工业生产效率很低。截至目前还没有其他更经济的方式获取双吲哚TIAs，而通过代谢工程等手段是目前提高TIAs产量的最有效方式，因此深入研究长春花生物碱合成的分子调控机制是提高TIAs产量的基础。
长春花所有的TIAs都来自中间前体3α(S)-异胡豆苷(stritosidine)，TIAs生物合成的上游分为环烯醚萜途径(多部酶促反应合成裂环马钱子苷(secologanin))和莽草酸途径(多部酶促反应合成色胺(tryptamine))。其中，裂环马钱子苷是由异戊烯基二磷酸(IPP)衍生而来。在IPP存在的情况下，吲哚生物碱主要通过MEP途径在质体中合成。进一步裂环马钱子苷和色胺通过异胡豆苷合酶(STR)缩合反应生成异胡豆苷。随后在下游途径中，异胡豆苷β-D-葡萄糖苷酶(SGD)作用下，3α(S)-异胡豆苷转化为strictosidine aglycone(异胡豆苷糖苷配基)，可用于合成各种TIAs。进一步通过多步酶促反应形成dihydroprecondylcarpine acetate(二氢前诱导卡宾乙酸酯)，然后在catharanthinesynthase(CS)(长春质碱合成酶)和tabersonine synthase(TS)(它波宁合成酶)作用下形成长春质碱和它波宁(tabersonine)。它波宁经过七步反应形成文多灵。最终长春质碱和文多灵在过氧化物酶1(PRX1)的作用下形成长春碱，生成中间产物α-3’，4’-脱水长春碱(α-3’，4’-anhydrovinblastine)，然后通过多个步骤生成脱水长春碱、长春碱和长春新碱。其中，DXS1、TDC、7-DLGT、7DLH、LAMT、SLS、Asα、STR为上游合成基因，SGD、REDOX2、SAT、HL1、HL2、DAT、PRX1为下游合成基因。
EIN3/EILs转录因子是乙烯信号转导途径中重要的核转录因子，目前已经从多种高等植物中分离得到，属于一个小的转录因子家族。这类转录因子在氨基酸序列N端高度保守，通过直接结合到初级乙烯反应原件(PERE)上来调节相关基因的表达。不仅参与果实成熟、花衰老、抗盐、抗冻、抗机械伤胁迫等重要生命活动，也参与调控植物次生代谢产物的合成。
CrEIL1是长春花中分离得到的一个EIN3/EILs转录因子，在长春花花瓣中瞬时表达显著提高长春碱的含量，表明这是一个潜在的、具有促进长春碱生物合成作用的转录因子。故该转录因子对于促进长春碱高效合成具有重要意义。已知研究中，长春花中响应乙烯信号的CrERF5转录因子对萜类吲哚生物碱合成具有调控作用，而长春花中乙烯信号通路中EIN3/EIL1类转录因子的基因功能鲜有报道。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种低成本、环保、可靠地提高长春花中长春碱产量的方法。
实现思路