本技术涉及生物化学检测技术,介绍了一种新型的实时监测细胞内ATP含量的感受器构建方法及其应用。该方法基于一种重组质粒,该质粒包含hDndB和DN-luc基因,两者通过IRES序列连接,实现共表达和独立翻译,避免了融合蛋白功能干扰。利用hDndB的ATP检测特性,与DN-luc含量正相关,通过检测细胞上清液中的双荧光素酶含量,可准确判断细胞内ATP含量。
背景技术
腺嘌呤核苷三磷酸(简称ATP),化学式为C10
H16
N5
O13
P3
,分子量为507.18,是一种不稳定的高能化合物,由1分子腺嘌呤,1分子核糖和3分子磷酸基团组成。
ATP作为细胞中的能量“货币”,几乎参与细胞所有生命活动,包括细胞生长、复制、衰老、癌变、应激。在细胞能量代谢中,ATP作为能量代谢的产物或原料,其含量的动态变化直接反映细胞的能量代谢方向。此外,在众多细胞代谢活动中,许多激酶均作为代谢反应的重要调节酶,如在GPCR信号通路中,PKA作为通路中的关键酶,活化后促进胞内第二信使的信号通路向核内传递;而细胞则通过调整胞内实时ATP含量,从而直接上调或抑制激酶活性,从而实现对胞内信号通路和其他代谢活动的调控。医学领域研究中,也有着胞内ATP含量的实时监控的需求。在糖尿病的检测、治疗中,AMPK的药物活化是一大研究方向,而AMPK在胞内的正常活性变化则直接受到胞内AMP/ATP含量的动态变化调控,因而ATP的实时含量便可作为AMPK药物的一种直接药效证明。此外,目前,包括糖尿病研究,药物的胞内药效检测手段几乎仅包含目的蛋白表达含量或是其转录本表达含量,而胞内的实时ATP含量不仅可作为细胞受药后的细胞状态指标,还可在以细胞能量代谢为靶点的药物研发中,作为其药效的直接指标。
目前ATP检测已有多种方式,如NADPH法和荧光素酶法,也开发出许多ATP检测试剂盒。其中,碧云天、yeasen、mce、biosharp、thermofisher生物科技公司的ATP检测试剂盒基于荧光素酶法,其原理为ATP在荧光素酶的作用下与底物荧光素反应产生荧光,当荧光素酶和底物荧光素均过量时,在一定浓度范围内荧光强度与ATP浓度成正比,从而通过测定荧光强度检测样品中ATP浓度。还有部分生物科技公司,如生工,使用NADPH法制作ATP检测试剂盒,原理为HexoKinase催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH,NADPH在340nm有特征吸收峰,NADPH和ATP含量成正比,以此反应ATP含量。
目前ATP检测已有多种方式,也开发出许多ATP检测试剂盒,但市面上常见的检测盒均需要破碎细胞,且不同的试剂盒根据其原理的差异,在细胞破碎的过程中使用多种不同的试剂,因而存在操作较繁琐的问题,也增加了实验过程的可能变量,且上述试剂盒均是对细胞破碎液中ATP含量进行检测,这使检测结果与胞内ATP含量存在着时间的滞后性,也对实验精度有所影响。而随着生物领域的研究不断深入,一种实时反应胞内ATP含量的技术的需求将愈发增大,而现在并没有可以实时反映细胞内ATP含量的检测方法。
实现思路