本技术涉及一种植物中高表达启动子PETS3及其应用。该启动子PETS3序列已在SEQ ID NO.1中展示。本发明从甘蓝型油菜中成功克隆出一种分生组织高表达水平启动子PETS3,其能显著增强异源基因Cas9在甘蓝型油菜茎分生组织中的表达,表达量是pro35S启动子的18倍以上。此外,PETS3也能在植物的根和愈伤组织中驱动基因高水平表达。本发明有效解决了油菜基因编辑中分生组织强启动子的缺乏问题,使用该启动子能缩短基因编辑周期,降低工作量,提高效率,对植物遗传育种和基因工程领域具有重要的应用价值。
背景技术
甘蓝型油菜是世界最重要的油料作物之一,利用基因工程手段对油菜种质资源的改良是一种高效的育种手段。用于驱动外源基因在宿主细胞中表达的启动子是基因工程中的重要工具。启动子可按照其驱动基因表达的行为被分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子等。其中,组成型启动子驱动基因在所有细胞或大部分细胞中高量表达,因此在应用中有较大限制,而组织特异性启动子和诱导型启动子可以控制目标基因在特定组织或特定条件下表达,在基因工程中有更大的应用潜力。例如,豇豆储藏蛋白基因8SGα启动子驱动基因在种子中特异性高效表达,可以作为生物反应器的高效特异启动子(ChenMX,Zheng SX,YangYN,et al.Strong seed-specific protein expression from theVigna radiata storage protein 8SGαpromoter in transgenic Arabidopsisseeds.Journal of Biotechnology,2014,174:49-56.);使用卵幼胚特异性启动子可以明显提高拟南芥中CRISPR/Cas9系统的工作效率(Wang,ZP,Xing,HL,Dong,L,et al.Eggcell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generateshomozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in a singlegeneration.Genome biology,2015,16:144-156)。
顶端分生组织是根和茎顶端可长期保持分生能力的原始细胞及其刚衍生的细胞。分生组织细胞分裂旺盛,是植物体其他各种组织和器官发生的来源。分生组织细胞的增殖和分化行为受到严格的调控,对整个植株的生长产生巨大的影响,如影响茎杆长度、叶片分布、果实数量等。在利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时,Cas9核酸酶及sgRNA的表达维持时间越长、表达水平越高,其效率也将越高,CRISPR/Cas9系统启动子通常为组成型启动子如Ubi和35S启动子,这类启动子在油菜中的效果不佳;卵细胞、幼胚特异性启动子在拟南芥基因编辑中得到了较好的效果,但油菜转化方法不同于拟南芥,本启动子不适用。而上述问题可通过使用在油菜分生组织高效表达的启动子,使Cas核酸酶或特定基因在分生组织中持续高效表达积累而解决。
目前,一些分生组织特异性启动子已经被鉴定和应用。如中国专利(专利号CN116676307A)报道了玉米根的维管束及分生组织高效表达启动子ZmIRT1主要在根的维管束及分生组织表达,但未与其他启动子对比表达效果。中国专利申请(专利号CN115125242A)公布了水稻分生组织强表达启动子OsNPY4,可驱动外源基因在水稻侧根和分蘖部位表达。但这些启动子驱动外源基因在分生组织中的表达水平相对于Ubi、35S等组成型启动子的情况未做对比。
而适用于油菜的分生组织高效表达启动子还未见报道。因此,开发适合油菜分子育种和基因编辑使用的内源强启动子是进一步发展油菜基因工程技术的基础,对提高油菜基因编辑效率以及育种效率有重要的应用价值。
实现思路