本技术介绍了一种基于CRISPR技术的高效方法，用于构建基因组大片段删除突变体。该方法涉及在基因簇中识别目标基因序列，设计特异性的CRISPR gRNA和扩增引物，利用PCR扩增gRNA骨架质粒，随后进行纯化、体外转录。将gRNA与Cas9蛋白共注射，并从基因组中提取DNA进行PCR扩增。通过T7E1酶切和琼脂糖凝胶电泳分析，计算条带灰度值以评估敲除效率，筛选出最优靶点组合。该方法首次实现了CRISPR单位点敲除效率的评估，筛选出高效的基因组大片段删除靶点组合，适用于脊椎动物基因组中大片段基因的高效删除。
背景技术
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌进化出的RNA介导的适应性防御系统，其主要功能是保护生物免受入侵病毒和质粒的侵害，利用向导RNA核酸酶对外源基因进行切割。相比于锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)，CRISPR系统通过导致修复错误的非同源末端连接，引起小的插入和删除(indels)从而破坏靶基因，已被广泛用于各种生物体中进行突变。CRISPR/Cas9系统具有操作简单、易于合成、打靶效率高、靶向精确和细胞毒性低等优势，而且在确保体细胞内对基因进行突变的同时，也能造成生殖细胞的突变，从而将突变基因传递到下一代。
然而，插入删除标记(indel)诱变并不适合所有目标：同一基因中可能存在多个转录变体或替代起始密码子(无论是否注释)，使得难以确定功能性蛋白质产物是否被有限的局部突变破坏；对于非编码RNA(ncRNA)基因、非翻译区或调控区，局部突变无力破坏这些基因或顺式元件的功能，仅通过靶向单个基因座也难以同时去除染色体上多个基因或一组相邻基因，通过CRISPR组合删除基因组长片段为实现编码基因和非编码基因的功能提供有效工具。
目前大片段删除技术已经应用于哺乳动物、鱼类、植物、细菌、真菌等生物体中(图12)。在CRISPR/Cas9介导的片段删除中，采用的普遍方法是在预删除片段两端各设置一个靶点，少数采取两端各设两对的方法，David等人在哺乳动物小鼠中针对TYR色素基因的上游关键调控序列设计1.2kbp的删除，通过不同浓度的一对gRNA和Cas9对小鼠受精卵进行显微注射，成功构建色素减少的小鼠并验证该调控序列的功能，同时发现在提升Cas9 mRNA和gRNA的浓度时片段删除的效率从23％提升到了36％。Xiao等人针对斑马鱼基因组，通过一对CRISPR或两对TALENs注射至斑马鱼胚胎中获得突变体及其后代，但很多未检测删除效率。除此之外，在兔中使用Cas9 mRNA与2对gRNA靶点混合的方法对105kbp的TYR基因进行删除，效率最高达到25％。在水稻中通过转入表达包含Cas9蛋白和一对gRNA的质粒，其中以16.7％的效率删除了245kbp的片段。由于细菌对于双链断裂的修复能力较差，Standage-Beier等人使用切割单链的Cas9 Nickase删除大肠杆菌基因，该核酸酶成本较高，打靶一个位点需要配合两个互补的gRNA，通过混合针对两个位点的2对gRNA和Cas9 Nickase，在大肠杆菌中删除了36和97kb的片段，删除成功率分别为20％和1％。此外，在大豆中也有大片段删除的相关报道。综上基因组大片段删除在各物种中的情况，片段删除距离在几百个碱基对到接近一兆左右，片段删除的效率位于1％-36％之间。在小鼠、兔、斑马鱼、大肠杆菌、大豆、水稻等模式生物中进行的片段删除平均效率在25％以下，效率普遍较低。并且上述工作采用注射Cas9和2对以下的gRNA进行大片段删除，缺少评估优化gRNA组合的操作步骤。
基因组片段缺失的疾病数量占总疾病数的比例约为17.7％，片段删除可以用于研究基因家族、调控元件等功能，从而揭示疾病机制。利用模式生物构建突变体在满足基础研究的同时，还可以进行药物筛选帮助寻找可能的药物。编码肌联蛋白的ttn1、ttn2基因突变与人类骨骼和心脏肌病有关，hox基因簇编码一个转录调控家族，在发育过程中塑造动物的头尾轴，hox基因突变或缺失会导致一系列发育障碍疾病。利用CRISPR进行单位点敲除可以实现引入局部的基因突变，从而使基因表达异常，不能合成正常的蛋白质。但是，生物体的DNA中存在大量基因或者说调控元件不直接表达蛋白质，而是通过间接方式影响蛋白质的合成。单位点敲除有时起不到敲除这些调控元件的作用，想要对这些调控元件或者基因簇进行编辑，需要使用片段删除的手段。在植物和动物中，片段删除可用于研究作物性状基因，删除反向调控元件等来实现精准的分子育种。在微生物工业领域中，利用细菌、真菌自身次生代谢产物可以制造抗生素、杀虫剂等，片段删除一些特定基因可以使其更耐储存或提高产量。医学上，片段删除可以用于研究长片段或成簇基因家族的功能。因此，不管是医疗、农业或工业生产等领域，提升基因编辑的效率均具有重要意义，目前片段删除的效率还普遍偏低，需要进一步开发高效的基因组片段删除手段。
实现思路