本技术公开了一种测定样本中神经酰胺的方法及其产品和应用,涉及生物检测技术领域,本发明提供了一种适用于同时检测多种神经酰胺的方法,该方法优化了色谱洗脱采用的流动相以及梯度洗脱程序,使得多种神经酰胺能够在4.5min内完成分离和检测,分析时间短、通量高,且避免或减少了干扰峰的影响,使得待测神经酰胺的检测信号能够与干扰峰有效分离,从而获得稳定性高、精准度好的检测结果。
背景技术
鉴于冠状动脉疾病的高发病率和高死亡率,预防冠状动脉患者的致命性和非致命性心肌梗死,仍然是临床上的挑战。每年稳定性冠状动脉患者的死亡率在1-3%之间,非致命性发病率在1-2%之间。在急性病症存活的急性冠状动脉综合征患者中,心肌梗死的死亡率明显升高(尤其在第一年内)。然而发病风险在各个病人中非常不同,这就需要有效的诊断、危险分层、病情监测和疗效评价的工具来提高病人的识别和管理。
冠状动脉疾病标志物是动脉粥样硬化发生发展过程中增加或减少的生物活性物质,可用于冠状动脉疾病的诊断、危险分层、病情监测和疗效评价。它会对冠状动脉疾病的临床治疗带来巨大的影响,因此为了满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求,高效、准确的标志物的研发亟待加速。
目前用于冠状动脉疾病诊断、危险分层、病情监测和疗效评价的标志物,大多由于缺乏灵敏度和特异性而不能为临床医生提供更多的参考价值。例如,血清中的总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与动脉粥样硬化相关联,其被长期用来进行心血管疾病的诊断、危险分层和预后。但是,这些传统的危险分子的测定不能识别出很大一部分具有高风险心血管疾病的病人。因此,除了低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)这些传统的危险分子,急需寻找一种更准确的、更具预测性的危险因子。
游离脂质组学分析显示一些脂质可能作为冠状动脉疾病的有效诊断、危险分层和预后的标志物。脂质组学研究发现在冠状动脉疾病患者中特定的神经酰胺种类与心血管死亡显著相关(Meikle,P.J.et al.Plasma lipidomic analysis of stable and unstablecoronary artery disease.Arterioscler Thromb Vasc Biol 31,2723-2732,doi:10.1161/ATVBAHA.111.234096(2011).)。神经酰胺是由鞘氨醇和脂肪酸组成。神经酰胺主要通过鞘磷脂酶通路产生,鞘磷脂酶分解鞘细胞膜上的磷脂并释放神经酰胺。同时神经酰胺可以通过新合成通路由六种脂酰选择性神经酰胺合成酶利用简单分子合成。不同的神经酰胺类分子具有特定的生理功能。几个关键的细胞因子(如肿瘤坏死因子和白介素)可以诱导炎性反应(如动脉粥样硬化和缺血再灌流损伤),而神经酰胺水平在这些炎性反应中升高。一些心血管危险因子和标志物(如氧化的低密度脂蛋白和同型半胱氨酸)可以增加神经酰胺的产生。另外,神经酰胺作为信号分子参与调控许多细胞反应和功能,包括分化、增值、细胞凋亡、活性氧产生和基因表达,这些作用直接参与心血管疾病的分子机制。
神经酰胺目前也是治疗冠状动脉疾病药物开发的一个重要靶点。研究证明,鞘磷脂的代谢过程是一个动态的过程,鞘磷脂的代谢物(包括神经酰胺、鞘氨醇)作为第二信使在冠状动脉疾病中起到重要作用(Kolesnick,R.The therapeutic potential ofmodulating the ceramide/sphingomyelin pathway.J Clin Invest 110,3-8,doi:10.1172/JCI16127(2002).)。当把神经酰胺类似物直接作用于受损的动脉时,可以表现出强烈的抗恶性细胞增生扩散的作用(Bourbon,N.A.,Yun,J.,Berkey,D.,Wang,Y.&Kester,M.Inhibitory actions of ceramide upon PKC-epsilon/ERK interactions.Am JPhysiol Cell Physiol 280,C1403-1411(2001).)。血管平滑肌细胞的新内膜增生和冠状动脉的二次阻塞是气囊血管成形术和动脉支架植入术后发生再狭窄的原因,影响全球300万接受冠状动脉血管成形术的患者。神经酰胺可以抑制由ERK激酶和AKT激酶级联反应诱导的血管平滑肌的增生。C6神经酰胺包被的气囊导管可以阻止拉伸诱导的血管平滑肌细胞的新内膜增生(Charles,R.et al.Ceramide-coated balloon catheters limit neointimalhyperplasia after stretch injury in carotid arteries.Circ Res 87,282-288(2000).)。
已有大量的分析方法来测量神经酰胺,包括薄层色谱法、常规液相色谱法、免疫化学方法、气相色谱法和串联质谱法。然而,大部分的方法都是为研究工作而非临床使用而设计的,这些方法的共同缺点是它们在分子种类水平上无法对神经酰胺进行分析,并缺乏选择性、通量低、精确度和准确性低,因此不能满足临床实验室的要求。我们同样不能利用传统的免疫实验方法来区分这四种神经酰胺,因为每种神经酰胺的抗原表位都太相似了。抗神经酰胺抗体识别一类神经酰胺分子,它们只在脂肪酸链长度上有所不同。因此,现有抗体的低选择性阻碍了临床有效免疫测定方法的发展(Krishnamurthy,K.,Dasgupta,S.&Bieberich,E.Development and characterization of a novel anti-ceramideantibody.J Lipid Res 48,968-975,doi:10.1194/jlr.D600043-JLR200(2007).)。而LC-MS/MS的主要优点在于结合色谱分离与质谱的精确监测,可以明确检测每种神经酰胺分子(Kauhanen,D.et al.Development and validation of a high-throughput LC-MS/MSassay for routine measurement of molecular ceramides.Anal Bioanal Chem 408,3475-3483,doi:10.1007/s00216-016-9425-z(2016).)。
鉴于此,特提出本发明。
实现思路