本技术涉及一种制备产β-半乳糖苷酶乳酸菌透性化细胞及富含低聚半乳糖酸乳的方法。该方法包括以下步骤:(1)将能产生β-半乳糖苷酶的乳酸菌接种于以乳糖为碳源的培养基中;(2)培养至适宜条件后,通过物理或化学方法处理,使乳酸菌细胞透性化;(3)将透性化细胞与乳糖混合,发酵产生低聚半乳糖酸;(4)收集发酵产物,制得富含低聚半乳糖酸的乳品。该方法可有效提高低聚半乳糖酸的产量和纯度,具有重要的工业应用价值。
背景技术
β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)是一种糖苷水解酶,也称为乳糖酶,具有水解和转半乳糖基活性,能够水解乳糖并合成GOS。目前商业化β-半乳糖苷酶主要来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulans),通过常规分离提取纯化手段获得酶液。纯化获得的酶液可直接用于乳糖水解转化或通过固定化处理后再用于乳糖水解转化,但传统的分离纯化造成用酶成本的提升,限制了β-半乳糖苷酶的应用。近年的研究发现,乳酸菌来源的β-半乳糖苷酶在水解乳糖合成GOS领域具有独特的优势,比如其制备的GOS产物益生指数更高,菌株本身具有GRAS地位安全性好。但乳酸菌来源的β-半乳糖苷酶主要为胞内酶,应用过程仍需要通过采用物理方法或化学方法来进行酶的分离提取。通过制备透性化细胞可以规避繁琐的酶分离提取纯化步骤,同时提高酶的活性和稳定性。专利CN 102994589 A使用无水乙醇对乳酸克鲁维酵母进行透性化处理,通过将透性细胞加入到乳糖溶液中培养制备GOS。此外,有研究报道利用氯仿再经冷冻干燥处理可以制备产β-半乳糖苷酶乳酸克鲁维酵母透性化细胞(Rodriguez-Colinas et.al.,J.Agric.Food Chem.,2011),用0.1%SDS和氯仿处理可获得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum MCC2156)的透性化细胞并用于乳糖水解和GOS合成(Gobinath et.al.,Biotechnology Letters,2014),但是以上透性化方法使用了乙醇或氯仿等有机溶剂,限制了其制备的全细胞催化剂在食品加工中的应用。专利CN 1737132利用重复冻融的方法处理环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)ATCC 31382、米曲霉(Aspergillus oryzae)ATCC 20423及拟热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)ATCC46764制备具有β-半乳糖苷酶活性的透性化细胞并用于GOS的合成,专利CN 102851220利用高压均质及超声波提取脆壁克鲁维酵母中β-半乳糖苷酶,但以上方法不适用于工业放大。
目前,GOS主要以乳糖为底物通过酶催化制备,产物中仍残留较多乳糖、葡萄糖和半乳糖,需要进一步通过柱层析进行分离纯化后方可添加在婴幼儿配方奶粉或其他乳制品中,这使得GOS的生产应用成本进一步提升。牛乳中含有4~5%的乳糖,通过β-半乳糖苷酶直接催化乳糖在牛乳中原位水解并合成GOS成为分离纯化GOS的一种替代方案。例如,发明专利CN 102232417将乳糖酶加入巴氏杀菌后的牛奶进行酶处理,生产GOS含量为0.2-1.2%的灭菌乳。发明专利CN 102369998 A使用来自曲霉菌(Aspergillus)、酵母菌(Saccharomyces)及克鲁维酵母(Kluyveromyces)来源的乳糖酶直接处理全脂牛乳,在50℃的温度下进行酶处理,获得0.1-5.19g/100g的GOS。Duraiswamy Gobinath等人使用SDS对植物乳植杆菌进行透性化,当乳糖浓度为40%(w/v)时,透性化处理12小时后GOS产率最高为34%(w/w)。Wang等人发现经乳酸菌素nisin处理的产β-半乳糖苷酶嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)细胞可以作为全细胞催化剂高效水解乳糖,但并未测试其能否合成GOS(Applied Microbiology and Biotechnology,2020)。
发明专利CN 114258950 A使用Nurica乳糖酶加入到热处理后的浓缩牛奶中低温搅拌15-30min,静置处理18-26h生产GOS,然后加入发酵剂保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌,两歧双歧杆菌、长双歧杆菌等益生菌进行酸乳发酵,制备含GOS酸乳。但目前尚未见采用冷冻干燥技术制备的乳酸菌透性化细胞作为全细胞催化剂直接在牛乳中水解乳糖合成GOS的报道。
实现思路