本技术涉及纳米复合材料技术领域,提供了一种磁性表位印迹凝胶聚合物,该聚合物能特异性吸附β-内酰胺酶SHV家族。制备方法包括利用SHV特异性分子作为模板,通过聚合反应形成印迹凝胶聚合物。该聚合物在检测和分离β-内酰胺酶SHV家族方面具有潜在应用价值。
背景技术
β-内酰胺类抗生素通过与细菌青霉素结合蛋白结合成稳定的酰基酶中间体,阻断细菌细胞壁肽聚糖的交联,从而产生抑菌作用。随着该类抗生素在临床上的广泛使用,细菌对其产生耐药愈发普遍:其中,青霉素结合蛋白构象改变或表达上调是革兰阳性菌最主要的耐药机制;虽然外膜孔蛋白的缺失及外排泵的表达是革兰阴性菌独有的耐药机制,但产生β-内酰胺酶(水解抗生素)却是该类菌最流行的耐药机制且具有显著的临床意义。
迄今,人们已发现4900余种β-内酰胺酶,根据酶的结构同源性,人们将之划分为四大类(A、B、C、D),包含数百种不同的家族,这些酶对β-内酰胺类抗生素的水解特性(即水解谱及抗酶抑制剂活性)不尽相同。在任一特定酶家族中,该家族所有成员具有相似的氨基酸序列:(i)第一个被报道的酶被冠以“-1”,如SHV-1,TEM-1和CTX-M-1,其他成员均由酶-1经若干个氨基酸取代后衍变而来,按照发现顺序分别冠以“-2”、“-3”、“-4”等,以此类推;(ii)氨基酸取代通常发生于蛋白序列上的某些特定区域,这些突变赋予了该家族成员新的水解特性;(iii)存在于家族成员中的某些保守的氨基酸序列,可作为该家族鉴定的重要依据。因此,互补于现有的基因检测技术,开发一种新颖的耐药检测策略,基于特异性多肽的识别与捕获实现特定酶家族及其所有成员的快速鉴定,具有十分重要的现实意义。
表位印迹技术是在传统分子印迹基础上发展起来的一种材料制备工艺,该技术以目标蛋白的特异性多肽(即表位)为模板,在交联剂作用下,将功能单体对模板分子的非共价作用记忆于聚合物中,洗脱模板后,聚合物中出现与表位多肽完全匹配的印迹孔穴,同时将功能单体的作用位点暴露于孔穴之中,由此制备的印迹聚合物能通过表位识别特异性吸附目标蛋白。与蛋白印迹相比,表位印迹具有多种优势:模板分子可通过人工合成获得;小分子多肽能耐受有机溶剂且在印迹过程中稳定;模板易于洗脱且印迹孔穴均一。近年来,表位印迹技术被广泛用于蛋白分离与纯化领域。
在表位印迹中,模板多肽的长度是影响聚合物印迹效果和识别特性的关键因素。一般地,理想的表位分子通常由9~15个氨基酸组成,以此为模板制备的印迹聚合物对表位分子和目标蛋白表现出良好的选择性和高度的亲和力。磁性表位印迹技术是以Fe3
O4
纳米颗粒为固相载体,在其表面合成印迹聚合物薄膜:因吸附位点均一分布于材料表面,不仅加快了目标分子与印迹孔穴间的传质速率,还保证了材料对目标分子的高容量吸附;加上Fe3
O4
易于磁性分离的特性,既简化了材料萃取流程,又提高了蛋白检测效率。
本发明选取β-内酰胺酶SHV家族为研究对象(SHV家族是A类β-内酰胺酶的典型代表,其包含240多种酶,这些酶有着不同的水解特性),以SHV家族特异性表位为模板,以亚微米Fe3
O4
颗粒为固相载体,利用表面表位印迹技术,制备SHV家族特异性的磁性表位印迹凝胶聚合物,并对其吸附性能作出详细评价。本发明同时验证了该聚合物具有从细菌裂解液等复杂基质中选择性分离SHV家族的性能,从而为细菌耐药检测新策略的开发奠定了坚实的理论与实践基础。
实现思路