本技术介绍了一种新型多羟基阳离子季铵盐磁珠,通过氨基环氧开环技术构建,用于病原气溶胶PCR检测中的微生物富集。该方法利用环氧季铵盐改性的四氧化三铁磁珠,有效提高病原微生物的捕获效率。
背景技术
空气采样和微生物检测是气溶胶检测中的重要环节,因此高效的采样和高灵敏度的检测方法是微生物气溶胶有效检测的保证。
空气微生物气溶胶采样的方法有很多种,如:自然沉淀法、固体撞击法、液体撞击法、离心法、旋风法、静电吸附法。液相旋风气溶胶采样器通常用于收集病毒气溶胶,采样后无需培养计数即可直接进行分子检测。与其他采样器相比,它操作简单,可以有效收集各种大小的气溶胶颗粒。目前,我们在临床上主要采用逆转录酶定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来检测COVID-19。随着COVID-19的发生和突变,检测过程中会不时出现假阴性结果,因此提倡使用更灵敏、更准确的诊断技术。
由于空气中病原微生物气溶胶的浓度相对较低,因此其检测需要每一步都具有很高的效率。许多对提高病毒基因组检测灵敏度感兴趣的团体都尝试了病毒的浓缩。病原微生物的超速离心已被证明是一种优越的浓缩方法,但非常耗时,不适合用于筛选目的。聚乙二醇沉淀技术简单,易于浓缩病原微生物,但提取的聚乙二醇过量会阻碍PCR反应。基因组捕获对于浓缩特定病毒基因组具有优势,但必须制备每种病毒的固定探针才能捕获多种病毒。因此,寻找一种更广谱、高效、简单可行的病原微生物浓缩发法用于提高病原气溶胶PCR检测的灵敏性具有重要意义。
传统方法的替代方法是使用涂有病毒特异性抗体的磁珠,这些磁珠可以有效地结合病毒,并促进其通过磁场浓缩和收集。特异性抗体磁珠是一种潜在提高病原气溶胶富集方法。但是抗体具有特异性,不能满足气溶胶的复杂多样性检测。因此,基于磁珠开发广谱高效的病原气溶胶富集系统能够在提高PCR检测灵敏度的同时,实现对多种病原气溶胶的高灵敏检测。病原气溶胶,包括空气中的细菌、真菌、病毒及其相关物质,如内毒素,都表现出负电性。季铵盐是一个带强正电荷的基团,几乎在所有pH范围内都表现出正电荷。因此,可以通过具有季铵基的磁珠实现对病原气溶胶的快速吸附。然后,通过添加适当的洗脱液,病原气溶胶可以转化为电中性状态,使其能够从吸附剂中分离到洗脱液中,从而实现高效富集。此外,空气中还存在其他负电性的有害物质,如内毒素等,也会与带正电荷的磁珠产生静电结合,从而降低病原气溶胶富集的效率。减少负电性杂质吸附的常用策略是用羟基进行表面修饰。例如,聚乙二醇(PEG)可以通过氢键在材料表面形成水合层,对有害物质施加空间排斥力。然而,PEG价格昂贵,需要严格的储存条件,因此不适合大规模样品制备。因此,通过简单方便的方法制备多羟基阳离子季铵盐磁珠用于病原气溶胶高效富集,实现PCR高灵敏检测,具有重要的实用性和意义。
实现思路