本技术涉及分子生物学、免疫学和病毒学技术,介绍了一种利用RT-LAMP-CRISPR/Cas12b技术的甜菜西方黄化病毒微流控检测试剂盒及其检测方法。该技术通过棉
背景技术
甜菜西方黄化病毒(beet western yellows virus,BWYV)最早于1960年在北美地区的萝卜和甜菜上发现。随后在捷克斯洛伐克、以色列、日本、中国等地的甜菜上均发现了该病毒。BWYV寄主范围十分广泛,可侵染150多种双子叶植物,特别是在侵染辣椒植株后,会导致叶片卷曲、皱缩和黄化,果实变色和变小,造成巨大经济损失。
目前,对BWYV的检测主要采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),但该方法存在依赖高价精密仪器、专业训练人员以及检测周期较长(大约2小时)等问题。规律成簇间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是由一系列重复DNA序列及间隔序列组成,与CRISPR相关蛋白(CRISPR associatedprotein,Cas)组成CRISPR/Cas系统,其广泛存在于古细菌和许多细菌中,是原核生物应对外来核酸入侵的重要免疫机制。最近研究表明,CRISPR/Cas系统不仅广泛应用于基因编辑领域,还展现出作为新型核酸检测方法的巨大潜力,特别是在病原物检测方面表现出高度实用性。目前多种Cas蛋白均可在sgRNA引导下有效切割靶基因序列,其中Cas12b蛋白除了具有优异的靶基因序列特异性识别能力外,还具备高效的反式切割活性。因此,可利用Cas12b蛋白被特定靶标激活的特性,实现对靶标单链DNA的特异性检测。目前已有的核酸快速检测方法包括环介导等温扩增技术(LAMP)和重组酶聚合酶扩增法(RPA)等,此类方法虽然摆脱了传统扩增技术对于升降温模块的依赖,但在实际应用中极易出现假阳性扩增。CRISPR/Cas12b系统与LAMP反应温度一致,并具有完美互补性,可显著提升等温扩增的特异性。然而,当前主要采用两步法检测策略,存在明显气溶胶污染风险。
因此,开发一种基于RTLAMP和CRISPR/Cas12b技术联合微流控芯片实现快速、低成本、一锅式田间检测BWYV相关病害的方法迫在眉睫。
通过上述分析,现有技术存在的问题及缺陷为:
当前主要采用两步法检测策略,存在明显气溶胶污染风险。
实现思路