本技术涉及酶基因工程领域,特别是一种甘油磷脂衍生物的制备技术。通过共表达聚磷酸激酶和甘油激酶,增强聚磷酸激酶ATP再生效率。
背景技术
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甘油衍生物是细胞功能中重要的代谢中间体,也是许多生物活性磷脂的起始化合物。基于酶法的甘油衍生物的合成方法不同于现有的化学合成方法,具有更温和的合成条件。酶法合成甘油衍生物涉及的酶包括甘油激酶(GK)、甘油-3-磷酸胞苷基转移酶(G3PCT)等。甘油激酶(E.C.2.7.1.30)能够特异性的催化甘油的磷酸化,生成甘油型磷脂酸(GPA)。甘油-3-磷酸胞苷基转移酶(2.7.7.39),可以催化胞苷-5’-三磷酸(CTP)与甘油型磷脂酸(GPA)反应生成甘油型磷脂酰单磷酸胞苷(GPCMP),是许多生物活性磷脂合成所需的中间体。
酶体外级联反应已成为一种环境友好和经济的有价值化学品生产的替代方法。体外生物系统的构建经常出现依赖于辅助因子的反应中需要昂贵的辅助因子的问题。重要的辅助因子之一,三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP),在许多生物催化级联中充当能量载体。是一种多功能核苷酸,在细胞生物学中发挥重要作用。
ATP依赖酶形成新的键,如酯键、硫酯键或酰胺键,同时与ATP水解反应耦合。许多有用的工业材料是由依赖ATP的酶合成的。体外能量依赖型酶级联在工业生产中的应用受到了昂贵底物ATP的限制,而且由于形成的二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)的抑制作用,常常存在问题。在ATP依赖的多酶促反应中,ATP再生系统有助于降低直接使用ATP的成本,促进工业过程的发展。
ATP再生的酶促系统在ATP依赖性酶的工业应用中具有重要意义。已经研究了几种类型的ATP再生反应,如磷酸烯醇式丙酮酸/丙酮酸激酶、磷酸乙酰基/醋酸酯激酶和基于聚磷酸(PolyP)/聚磷酸激酶(PPK)的系统。与磷酸烯醇丙酮酸和乙酰磷酸等磷酸盐供体相比,PolyP具有成本低、稳定性高、易获得等优点,被广泛应用于ATP再生的底物。PolyP是一种由磷酸残基通过酸酐键连接而成的无机聚合物,在细胞生物过程中起着重要作用。它在广泛的温度、pH值和氧化剂条件下都是稳定的。依赖ATP的酶通常消耗ATP并释放无机磷酸盐和ADP。PPK可以以ADP和PolyP为底物合成ATP,适合于这些需要消耗ATP酶的偶联反应体系。
因此,我们建立了基于ATP再生系统的催化制备GPA和GPCMP的合成路线。
实现思路