本技术涉及分子生物学技术领域,专注于对CRISPR/Cas12j-8系统的工程化改造及其应用。旨在解决CRISPR/Cas12j-8系统在基因编辑中的技术难题,提升其效率和精确性。
背景技术
CRISPR-Cas系统的出现,特别是CRISPR-Cas9和Cas12a,极大地改变了基因组编辑领域,使得在包括人类和植物基因组在内的众多生物中实现精确的基因改造成为可能。在植物中,病毒诱导的基因组编辑(VIGE)由于核酸酶体积较大面临类似的限制。为了解决这些问题,大量研究致力于开发更小、更紧凑的Cas蛋白。该领域的最新进展已促使研究人员发现了几种具有潜力的候选者,其中包括紧凑型Cas9变体、 Cas12f (400~700个氨基酸 )、TnpB (约400个氨基酸) 以及 IscB (约400个氨基酸),其较小的分子量预计将简化病毒载体的构建,从而扩大病毒介导的基因组编辑应用的潜力。然而,尽管有这些进展,这些较小核酸酶在植物系统中的基因编辑效率仍然不够理想。
最近在噬菌体中发现的CRISPR/Cas12j(Casφ)系统在基因组编辑工具中代表了一个重要的进展。该系统因其紧凑的大小(700~800个氨基酸)和对5′-TBN-3′原间隔区相邻基序(PAMs)的偏好而引起广泛关注。尽管尺寸较小,Cas12j系统在哺乳动物细胞中展现了有前景的基因组编辑能力。目前报道的CRISPR/Cas12j 系统有10种同源蛋白,CRISPR/Cas12j-1到CRISPR/Cas12j-9,及最新报道的 CRISPR/Cas12j-SF05。野生型Cas12j-2在拟南芥中的编辑效率低至0.3%,而工程化的Cas12j-2变体编辑效率可提高至6%。在水稻(Oryza sativa)等单子叶植物中,具有遗传性的编辑效率甚至更低,在稳定转化的品系中仅达到1.2%。通过将工程化的Cas12j-2变体与优化的crRNA结合使用,在水稻中的基因组编辑效率范围在2%至78%之间。在小麦(Triticum aestivum)和黑麦(Secale cereale)中,通过优化crRNA并引入核定位信号(NLS),基因组编辑效率得到了提高,从而改善了基因敲除和碱基编辑效果。此外,最近报道的Cas12j-SF05在植物基因组编辑中展现了潜力,在水稻中的编辑效率可达20%。尽管取得了这些进展,Cas12j系统的整体效率仍低于更为成熟的工具,如SpCas9。除了Cas12j-2和Cas12j-SF05之外,CRISPR/Cas12j-8系统最近在人体细胞中展现了有效性,其特点是低脱靶活性和对PAM邻近区域单核苷酸错配的高度特异性。然而,其在植物基因组编辑中的潜力仍未得到充分探索,验证仅限于水稻原生质体,其中其编辑效率较低(<2.4%)。此外,Cas12j缺少HNH结构域,这显著限制了其碱基编辑能力。因此,其在植物中进行碱基编辑的潜力尚未得到充分开发。
实现思路