本研究介绍了一种利用光活化寡核苷酸来评估固定细胞基因组图谱的新方法。这些寡核苷酸能够特异性标记细胞核、线粒体或细胞质,并在激活后通过延伸过程进行分析。
背景技术
基因的空间排列、染色质的结构和调节DNA元件的可及性控制细胞的细胞核架构的表达(Sherwood等人,2014)。染色质结构继而由DNA的表观遗传甲基化、DNA结合蛋白的修饰、以及远端顺式和反式染色体区的动力学控制。基因组的组织是复杂和动态的。例如,通过染色质折叠的变化,远端增强子变得非常接近经调节的基因的启动子,各种团体估计基因组中存在数百万个这种潜在的增强子相互作用(Lai等人,2015)。已经对许多基因的这种染色质相互作用进行了作图,所述作图主要使用细胞群,在所述细胞群中分离的细胞核经化学交联以保持近端启动子相互作用。在交联后,往往使用针对转录因子或经修饰的蛋白(例如组蛋白)的抗体或简单地通过针对特定目的位点的PCR来鉴定目的位点(Simonis等人,2006)。随着染色质作图程序(染色体-构象-捕获)的发展,高级染色质结构的分析已经变得更加容易,所述染色质作图程序包括3C、4C、5C和HiC(de Wit和de Laat,2012;Dekker等人,2013)。这些程序使用交联染色质的限制性酶切、各种PCR扩增策略,并且将接头连接至DNA上,之后对产物进行测序。由于对DNA的大量操纵,这些过程中的每一过程都变得选择性更低。据估计,使用HiC细胞群只能捕获20%至70%的跨染色体接触。此外,虽然HiC对染色体拓扑分析而言更好,但它的灵敏性较低,这主要是因为连接过程的低效率。
最近一种鉴定单个细胞中的开放染色质的方法利用了用于转座酶可及染色质(ATACseq)的测定(Buenrostro等人,2013)。这种方法使用Tn5转座酶来标记基因组的可及区域。当用于单个细胞上时,单细胞ATACseq数据以来自多个细胞的合并数据的形式呈现,因为每个转座子插入仅提供用于对每个转座子的单个等位基因区的检测,从而除非通过多个细胞数据的合计,否则禁止第二次检测所述单个等位基因区。该程序允许对一些调节位点进行作图,但据报道在针对大量细胞时遗漏了许多先前通过3C/4C鉴定出的位点。事实上,只有9.4%的启动子在ATAC中被代表。进一步地,Tn5整合进基因组中并不是完全随机的,因此会遗漏一些序列。最后,ATAC允许在基因组范围的规模上进行分析,除非通过随机探索,否则几乎没有能力驱动基因特异性分析。为了在细胞水平上评定这种3D结构,需要评定单独细胞的基因组的开放构象状态的方法。
实现思路