本研究探讨了修饰大肠杆菌Nissle 1917菌株(EcN)在胃肠道疾病治疗中的潜力。研究基于对EcN菌株的深入分析，旨在开发新的治疗策略。
背景技术
益生菌大肠杆菌菌株Nissle1917(EcN)是在第一次世界大战期间由AlfredNissle在抵抗严重腹泻爆发的士兵中分离得到的(1,2)。最初研究了EcN对抗细菌性胃肠感染的能力。已证实肠道血清型鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)(3，4)阻止肠道定植并且表现出对肠出血性大肠杆菌菌株的抗菌活性(5)。EcN是人肠道的优异定植剂，对各种肠道功能障碍表现出有益作用，诸如婴儿和幼儿的急性腹泻(6)、慢性便秘(7)和肠易激综合征患者的腹痛(8)。它已被广泛用于治疗炎症性肠病(1)，并已被证明与金标准美沙拉嗪一样有效，用于维持儿童和成人溃疡性结肠炎的缓解(9)。
EcN益生菌活性被认为是基于多种特殊特性和适应性决定因素，包括对其他细菌的抗菌活性(10)。归功于大量的铁载体(肠杆菌素、沙莫氏菌素、耶尔森菌素和产气杆菌素)和多种铁载体受体和铁转运系统，EcN通过竞争铁来减少S.Typhimurium肠道定植(3)。肠杆菌素、沙莫氏菌素和耶尔森菌素是非核糖体肽(NRP)或聚酮化合物(PK)-NRP杂交体，它们由NRP合成酶和由同源磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)活化的PK合酶(NRPS和PKS)合成。除了这种对限制性营养素的竞争外，EcN还表现出与两种小菌素(Mcc)，H47(MccH47)和M(MccM)(4,11-13))的产生相关的直接抗菌活性。Mcc是分泌的低分子量肽，由核糖体合成并经过翻译后修饰，并且其对系统发育相关细菌显示出有效的杀菌活性(14,15)。MccH47和MccM被称为“铁载体-Mcc”，因为它们通过儿茶酚铁载体的连接在翻译后进行了修饰(13,16)。Mcc肽的C末端与肠杆菌素的线性化和糖基化衍生物共价结合(13,16,17)。该铁载体部分被目标细菌的儿茶酚酸-铁载体识别(12,16)。因此，铁载体-Mcc可以通过模仿铁-铁载体复合物，通过“特洛伊木马”策略进入并杀死敏感细菌。
比较基因组分析表明，EcN与致病性大肠杆菌菌株诸如尿路致病菌株CFT073密切相关(18-20)。EcN和CFT073共享八个基因组岛，包括编码NRPS-PKS装配线的pks/clb岛，该装配线可合成基因毒素大肠杆菌素(colibactin)(21,22)。大肠杆菌素作为前药部分产生，通过外排泵ClbM(23)在周质中输出，然后被具有肽酶活性的周质膜结合ClbP蛋白水解，释放活性大肠杆菌素(24,25)。大肠杆菌素不仅是一种真正的毒力因子(26,27)，而且还是一种推定的致癌化合物。大肠杆菌素使宿主细胞DNA烷基化，导致DNA交联、双链断裂、染色体畸变以及体外和体内基因突变(21,22,28-30)。在结肠直肠癌患者的活检中，产大肠杆菌素的大肠杆菌的比例过高(31,32)，并且在小鼠模型中显示它们促进结肠直肠癌(31,33)。
当发明人显示pks/clb岛的某些酶能够合成镇痛脂肽(34)并且EcN的益生菌特性与致病岛的存在有关(35)时，揭示了EcN的致病性和益生菌潜力之间的矛盾。在Olier etal.(2012)的研究中，发明人使编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)ClbA的基因失活，该基因被认为是大肠杆菌素合成的特异性基因。但是，最近的研究表明，ClbA具有多效作用，并且还调节铁载体的合成以及镇痛脂肽的合成(34,36)。正如所预期的，使用产生基因毒素的益生菌菌株是一个公共卫生问题。因此，发明人试图将基因毒性与益生菌活性明确分离。在这项研究中，发明人利用他们对pks/clb岛直接或间接产生的大肠杆菌素和其他次级代谢物的生物合成途径的知识，专门消除了大肠杆菌素的基因毒性活性。发明人检查了突变体抑制病原菌生长同时仍产生有益的次级代谢物的能力。发明人成功地将益生菌活性与基因毒性活性分离，从而为优化EcN开辟了道路。但是，发明人惊讶地观察到pks/clb岛与EcN益生菌活性的联系比我们预期的更加密切，并且细菌中的致病性和益生菌特性是共同进化的。EcN在某种程度上就像“神药”阿司匹林。尽管与阿司匹林一样，这种细菌菌株已成功使用了一个多世纪，但了解作用方法并考虑安全性和潜在副作用至关重要。
实现思路