本技术介绍了一种利用I型内含子的RNA体外环化和滚环翻译技术及其应用。该技术通过分离I型内含子的特定非互补区域，开发出一种核糖核酸构建体，利用核酶自剪接机制实现RNA的体外环化和滚环翻译。
背景技术
环状RNA(circularRNA)是一类无5’帽子和3’poly(A)尾的单链RNA，由共价键相连形成闭合的环状拓扑结构。因环状结构可使其免于核酸酶的降解，具有较高的稳定性。在环状RNA被发现的一段时间里，它们被认为是罕见的、无功能的异常剪接副产物。然而，在过去的十年中，有一个根本性的转变，即认为环状RNA是生物学中普遍存在的功能重要分子。这在很大程度上归因于RNA-seq技术的出现，该技术揭示了环状RNA在真核生物中普遍存在并具有进化保守性。环状RNA在RNA配体、miRNA海绵、蛋白质海绵、反义环状分子、先天免疫激活因子、先天免疫抑制因子、蛋白质翻译和生物标志物方面都有着特定的生物学功能。
在生物体中，pre-mRNA去除内含子后连接成mRNA，这是由剪接体作用于内含子的5’端和3’端剪接位点，导致内含子被剪接，外显子连接形成mRNA，即forward splicing(正向剪接)。然而，大多数生物体内产生的环状RNA却不是通过forward splicing，而是采用back splicing(反向剪接)方式来实现的。反向剪接不是发生在内含子的两端，而是发生在外显子的两端(即第一个内含子的3’端，第二个内含子的5’端)，这种作用的剪接会将外显子环化，形成环状RNA。
因其较高的稳定性，使得人们对于环状RNA在核酸药物方面的应用引发了关注，尤其在体外制备环状RNA。目前的方法主要有：一是化学合成，通过对特殊的核苷酸衍生物进行合成与连接；二是通过核酸连接酶催化线性RNA的末端连接；三是基于内含子核酶的自剪接特性，将线性RNA的末端连接。
核酸药物是小分子药物、蛋白药物之后的又一研究较多的药物，而环状RNA在线性RNA的推动下，得到了极大的发展。内源的环状RNA可作为药物新靶点或疾病诊断的标志物，而人工制备的环状RNA可针对多种靶点并在细胞内发挥作用。目前环状RNA在感染性疫苗、肿瘤疫苗、CAR-T、蛋白替代疗法、基因编辑等领域有很大突破，所以环状RNA的制备对于其应用至关重要。
而基于核酶自剪接机制来制备环状RNA，目前主要有Group I intron(I型内含子)和Group II intron(II型内含子)自剪接的方法。其中，I型内含子自剪接已有采用Anabaena tRNA Leu基因或T4噬菌体的胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,td)基因上的I型内含子序列，这两种I型内含子都已被证实可以高效促进RNA的环化。主要思路是利用PIE系统对内含子进行改造，一般包括3’内含子、相邻外显子E2、目的基因、相邻外显子E1、5’内含子。RNA的环化过程大致如下：(1)一个鸟苷亲核物攻击E1剪接位点并置换3’末端；(2)中间体的3’末端进一步攻击E2剪接位点，从而形成环状RNA。
近期报道有利用四膜虫I型内含子，反式剪接核酶通过内导序列IGS(5’-GNNNNN-3’)，识别与之特异性碱基互补配对的底物RNA上的目标位点(5’-NNNNNU-3’)，形成P1螺旋结构。P1和P10螺旋分别定义5’和3’剪接位点。将核酶识别的靶序列放置于目的基因的3’端，将带有IGS的核酶序列放置于目的基因的5’端，无需携带AS、ABS、P10序列就能实现环化(Lee,K.H.,et al.,Efficient circular RNA engineering by end-to-end self-targeting and splicing reaction using Tetrahymena group I intron ribozyme.MolTher Nucleic Acids,2023.33:p.587-598)。
现有环化技术还存在一些不可解决的问题：核酶自剪接机制来制备环状RNA，由于RNA序列的不同使形成的环状RNA结构存在巨大差异，导致环化效率低、先天免疫原性高和表达低。其中Ana、T4的I型内含子剪接会引入外源外显子序列，这可能会对环状RNA的功能产生影响，以及会带来较高的先天免疫原性。四膜虫的I型内含子在无同源臂存在的情况下，环化效率相对较低。而且，环状RNA翻译的效率也限制了该技术的应用。
鉴于此，需要一种提高环化效率，减少外源序列，降低免疫原性，提高表达量的环状RNA制备及翻译方法，故提出本发明。
实现思路