本技术涉及基因工程技术领域,旨在提供一种增强β-熊果苷合成能力的毕赤酵母菌株。该菌株通过整合β-熊果苷合成途径至HIS位点,并在Int1位点过表达莽草酸途径关键基因,优化甲醇浓度后,显著提升了β-熊果苷的产量,从1.57 g/L增至6.33 g/L,增幅达3.03倍。在5 L发酵罐中,熊果苷产量高达128.6 g/L,产率为1.33 g/g DCW。该制备方法转化效率高,成本低,操作简便,具有广泛的工业化应用潜力。
背景技术
熊果苷最初由熊果等植物的叶子中分离,具有美白、抗炎症、抗衰老和抗氧化等多种生物活性,被广泛应用于保健品、化妆品和治疗药物等领域。在经济快速发展和生活水平提高的推动下,人们对健康和美容越来越重视,熊果苷的市场需求剧增。熊果苷依结构不同可分为α型和β型,可以通过抑制酪氨酸酶的活性或者减少其表达以达到美白的效果,当前应用最多和有详尽研究的主要是β型。在过去,β-熊果苷的获得方式主要有植物提取、植物组织培养、化学合成和酶催化法。然而,植物提取和植物组织培养存在着生产成本高、生产周期长等弊端。而化学合成需要大量的有机溶剂,并且多在高温高压下反应,副反应多,产物结构特异性差。酶催化法则需要纯酶催化,酶制剂成本一定程度上制约放大生产。在微生物细胞中设计并建立高效的生物合成路线,利用微生物制造生产β-熊果苷具有原料廉价、环境友好、生产高效等众多优势。
甲醇是廉价易得的有机碳一原料,毕赤酵母能够在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长,可以将甲醇转化为高值化合物。毕赤酵母已被认定为GRAS菌株,其安全性得到广泛认同。毕赤酵母同时具有以下优势:(1)是最简单的真核表达系统,与原核表达系统相比,毕赤酵母表达系统具有丰富的翻译后修饰机制且无内毒素合成。(2)具有严格受甲醇调控的AOX1启动子,可选择性的诱导特定基因的表达,更有利于在发酵过程中实现细胞发酵与产品生产分段进行,减少细胞生长的负效应。(3)是Crabtree阴性菌株,能够实现高密度发酵。(4)遗传背景清晰,GS115基因组测序结果已经被详细注释。因此,在甲醇的生物转化领域,毕赤酵母正在成为越来越有吸引力的底盘。利用代谢工程手段对毕赤酵母进行改造有望实现β-熊果苷的快速高效合成。
实现思路